Understanding the survival mechanisms of Campylobacter jejuni in human hosts and in the environment

Abstract

Campylobacter es un patógeno bacteriano que se transmite principalmente a través de alimentos contaminados causando la llamada campilobacteriosis, la enfermedad gastrointestinal más frecuentemente notificada en la Unión Europea desde 2005, con más de 127.000 casos en humanos en 2021. En la mayoría de casos notificados, Campylobacter jejuni es la especie predominante, lo que representa una seria amenaza para la salud humana, provocando además un impacto negativo en la economía de los sistemas de salud públicos. Con la finalidad de mejorar la seguridad alimentaria, en esta Tesis Doctoral se profundiza en los mecanismos moleculares de patogenicidad y virulencia de C. jejuni para resistir a las duras condiciones ambientales existentes a lo largo de la cadena de suministro alimentaria y sobrevivir a los mecanismos de defensa del huésped humano. El estudio de las bases moleculares de patogenicidad de C. jejuni requiere la secuenciación del genoma completo (WGS; del inglés, Whole-Genome Sequencing) de los aislados, así como el análisis genómico posterior de los datos secuenciados. Surge de este modo la necesidad de desarrollar un flujo de trabajo ―CamPype― que permita analizar de manera automática datos WGS especialmente de esta bacteria. CamPype permite al usuario personalizar el análisis WGS a realizar, incluyendo el control de calidad y filtrado de las lecturas, la extensión y el ensamblaje de las lecturas, la tipificación bacteriana, la anotación del genoma, la búsqueda de genes de resistencia a antibióticos, genes de virulencia y plásmidos, construcción de pangenoma e identificación de variantes nucleotídicas. Para validar CamPype, se analizaron 145 genomas de Campylobacter spp, incluyendo las especies C. jejuni, Campylobacter coli y Campylobacter lari, correspondientes a aislados procedentes de distintas etapas de la cadena de suministro avícola de España, así como cepas clínicas de Burgos. El estudio reveló una amplia diversidad genética entre los aislados, con un predominio del Complejo Clonal 21, el cual se identificó en todos los puntos de muestreo. Asimismo, se identificaron varios perfiles de virulencia y resistencia a antibióticos, con una mayor frecuencia de genes de virulencia en la especie C. jejuni que podría explicar su mayor abundancia en el ambiente. También se observaron altas tasas de genes de resistencia a antibióticos, especialmente frente a β-lactámicos, fluoroquinolonas y tetraciclinas, sobre todo en C. jejuni y C. coli, que justifican la amenaza para la salud mundial del aumento de la resistencia a los antibióticos. En el camino hacia comprender el comportamiento de Campylobacter en el ambiente, dos aislados de C. jejuni que habían infectado a dos hermanos de la misma familia a la vez se compararon genómicamente para encontrar las causas moleculares que llevaron al niño a padecer perimiocarditis después de sufrir campilobacteriosis. Los aislados resultaron ser clones de la misma bacteria y solo se diferenciaron en 16 polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs; del inglés, Single Nucleotide Polymorphism), que afectaban principalmente al estado encendido/apagado de genes hipervariables. Estas diferencias sugieren que, cuando se produce la infección del huésped humano, la bacteria es capaz de modular la expresión de ciertos genes para adaptar su comportamiento al entorno, lo que puede provocar el desarrollo de complicaciones posteriores en el huésped según su estado. Las dos cepas anteriores se caracterizaron fenotípicamente, junto con otros tres aislados representantes de distintos eslabones de la cadena de suministro avícola, y sus genomas también se analizaron en busca de posibles marcadores genéticos responsables de los fenotipos observados. En concreto, se evaluó el comportamiento de los aislados frente a situaciones de estrés típicas de la cadena de suministro avícola, como su capacidad de tolerar el oxígeno y el estrés oxidativo, así como su habilidad para formar biofilm como estrategia adaptativa en la industria alimentaria, la cual depende de la movilidad bacteriana. Los aislados combinaron diferentes comportamientos fenotípicos, con especial relevancia la diferente capacidad de nado de los dos aislados relacionados con el caso de la perimiocarditis. Además, el análisis comparativo de los genomas reveló distintos perfiles de genes asociados a las estrategias de supervivencia evaluadas, aunque el mecanismo molecular subyacente de cada fenotipo fue principalmente el cambio de fase de genes hipervariables, que fue crucial para modular los diversos mecanismos de supervivencia adoptados por la bacteria. La diferente capacidad de nado de los dos aislados relacionados con el caso de perimiocarditis condujo hacia un estudio en profundidad del fenotipo de motilidad en C. jejuni. Este estudio reveló, de nuevo, una gran diversidad en la capacidad de nado de la bacteria, así como de patrones de genes asociados a este fenotipo y de fasotipos ―combinaciones del estado encendido/apagado de genes hipervariables―. Esto indica que la motilidad es un fenotipo complejo que combina distintos mecanismos genéticos pero complementarios, aunque el acortamiento de proteínas como consecuencia de mutaciones puntuales o el estado de fase de aquellos genes hipervariables, donde destacan los implicados en la glicosilación del flagelo, resultan decisivos para explicar la variabilidad de este fenotipo. El análisis anterior se complementó con un estudio de asociación genoma-fenotipo por sus siglas en inglés GWAS (Genome-Wide Association Study) que reveló nuevos hallazgos implicados en el fenotipo de la motilidad desde un punto de vista estadístico. Concretamente, hasta cuatro regiones del genoma parecieron estar implicadas en la menor o mayor capacidad de nado de la bacteria, regiones que codifican para proteínas de membrana, transmembrana, periplásmicas y de la cápsula, que sugieren un papel fundamental de la estructura y composición de la membrana y la cápsula en el desempeño de la bacteria en ambientes viscosos. Además de la necesidad del correcto ensamblaje del flagelo en un proceso especialmente coordinado, transportadores ABC de fosfatos y de unión de ATP asociados a la membrana podrían ser claves en la transferencia de nutrientes para la generación de la fuerza protón-motriz a través de la membrana necesaria para la rotación del flagelo a mayor o menor velocidad permitiendo distancias de nado de la bacteria más largas o cortas. De esta forma, estos dos últimos estudios ponen de manifiesto la importancia que tiene para entender el fenotipo de la motilidad en C. jejuni el estudio tanto de los genes directamente implicados en la construcción del flagelo, como de aquellos genes responsables de poner en marcha el funcionamiento de esta estructura filamentosa. En definitiva, esta Tesis Doctoral demuestra el potencial de CamPype para caracterizar genómicamente aislados de distintas especies y orígenes generando nuevos datos útiles para posteriores análisis más específicos que permiten profundizar más aún en el estudio de las bases moleculares de patogenicidad de C. jejuni. La bacteria se caracteriza por su habilidad para combinar eficientemente diversos y complejos mecanismos genéticos, entre los que se encuentran factores de virulencia implicados en múltiples procesos, varios de los cuales están afectados por el cambio de fase y que determinan distintos fenotipos. Aunque de todos estos, el cambio de fase es el mecanismo que otorga a la bacteria la ventaja adaptativa esencial para hacer frente a situaciones de estrés y adaptarse al huésped, lo que hace que el comportamiento de la bacteria pueda llegar a ser impredecible y potencia su prevalencia en el ambiente.

Campylobacter is a bacterial pathogen that is transmitted mainly through contaminated food causing the so-called campylobacteriosis, the most frequently reported gastrointestinal disease in the European Union since 2005, with more than 127,000 human cases in 2021. Although campylobacteriosis is a self-limiting disease and the use of antibiotics is reserved for the treatment of the most severe cases and immunocompromised patients, in extreme situations, it can trigger complications such as neurological disorders like the Guillain-Barré syndrome or reactive arthritis, and myocarditis, among others. In most reported cases, Campylobacter jejuni is the predominant species, which represents a serious threat to human health, causing a negative impact on the economy of public health systems. Therefore, this Doctoral Thesis aims to study in more detail the molecular mechanisms of pathogenicity and virulence of C. jejuni to resist the harsh environmental conditions existing along the food supply chain and survive the defense mechanisms of the human host with the purpose of improving food safety. The study of the molecular bases of C. jejuni pathogenicity requires Whole-Genome Sequencing (WGS) of the isolates, as well as subsequent genome analysis of the sequenced data. This arises the need to develop a workflow ―CamPype― to automatically analyse WGS data, especially of this genus. CamPype allows the user to customize the WGS analysis to be performed, including quality control of raw reads and read quality filtering, read extension and assembly, bacterial typing, genome annotation, searching for antibiotic resistance and virulence genes, and plasmids, pangenome construction and identification of nucleotide variants. To validate CamPype, 145 Campylobacter spp. genomes, including the species C. jejuni, Campylobacter coli and Campylobacter lari, corresponding to isolates from different stages of the poultry supply chain, as well as clinical strains, from Spain were analysed. The study revealed a wide genetic diversity between and within these species, with a predominance of the lineage Clonal Complex (CC)21, which was identified at all sampling locations. Likewise, several virulence and antibiotic resistance profiles were identified, with a higher frequency of virulence genes found in the species C. jejuni that could explain its greater abundance in the environment. High rates of antibiotic resistance genes were observed, especially against β-lactams, fluoroquinolones and tetracyclines, especially in C. jejuni and C. coli, which justify the threat to global health of increasing antibiotic resistance. On the way to understanding the behaviour of Campylobacter in the environment, two isolates of C. jejuni that had infected two children from the same family at the same time were genomically compared to find the molecular traits that led the boy to suffer from perimyocarditis after the episode of campylobacteriosis. The isolates turned out to be clones of the same bacteria and only differed in 16 Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), which mainly affected the ON/OFF state of hypervariable genes. These differences suggest that, when infection of the human host occurs, the bacteria are able to modulate the expression of certain genes to adapt its behaviour to the environment, which can lead to the development of subsequent complications in the host depending on his/her state. The two previous strains were also phenotypically characterized, together with three different C. jejuni isolates representing different stages of the poultry supply chain, whose genomes were analysed to search for possible genetic markers responsible for the observed phenotypes. Specifically, the behaviour of the isolates was evaluated against typical stress conditions found in the poultry supply chain, such as their ability to tolerate oxygen and oxidative stress, as well as their ability to form biofilm as an adaptive strategy in the food industry, which depends on bacterial motility. The isolates combined different phenotypic behaviours, with special relevance the different swimming ability of the two isolates related to the perimyocarditis case. Furthermore, the comparative analysis of the genomes revealed differences in the pattern of genes associated with the survival strategies evaluated, although the underlying molecular mechanism of each phenotype was mainly the phase variation of hypervariable genes, which was crucial to modulate the diverse survival mechanisms adopted by the bacteria. The different swimming ability of the two isolates related to the perimyocarditis case led to an in-depth study of the motility phenotype in C. jejuni, which again revealed a great diversity in the swimming ability of the bacteria, as well as in the patterns of genes associated with this phenotype and in phasotypes ―combinations of the ON/OFF state of hypervariable genes―. This indicates that motility is a complex phenotype that combines distinct but complementary genetic mechanisms, which determine different swimming abilities. Among these mechanisms, there exists the presence of genes that code for structural proteins of the flagellum, glycosylation proteins of the flagellum that modify its composition, regulatory proteins and chemoreceptors, although the shortening of proteins as a consequence of point mutations or the expression state of those hypervariable genes, which those involved in the glycosylation of the flagellum stand out, are decisive to explain the variability of this phenotype. The previous analysis was complemented with a Genome-Wide Association Study (GWAS) that revealed new findings involved in the motility phenotype from a statistical point of view, considering both the set of the genes and mutations found among all isolates. In particular, up to four regions in the genome seemed to be involved in the greater or lesser swimming ability of the bacteria, regions that code for membrane, transmembrane, periplasmic and capsule proteins, which suggest a fundamental role for the structure and composition of the membrane and capsule in the performance of the bacteria in viscous environments. In addition to the need for correct assembly of the flagellum in a highly ordered process, the phosphate ABC and ATP-binding transporters could be key in the transference of nutrients for the generation of the proton-motive force across the membrane, necessary for the rotation of the flagellum at greater or lesser speed allowing longer or shorter swimming distances of the bacteria. In this way, these last two studies highlight the importance for understanding the motility phenotype in C. jejuni of studying both the genes directly involved in the construction of the flagellum and those genes responsible for starting up the functioning of this filamentous structure. In conclusion, this Doctoral Thesis demonstrates the potential of CamPype to genomically characterize isolates from different species and origins, generating new data useful for subsequent more specific analyses that allow further studies of the molecular bases of C. jejuni pathogenicity. The bacteria are characterized by their ability to efficiently combine diverse and complex genetic mechanisms, among which there are virulence factors involved in multiple processes, several of which are affected by phase variation and that determine different phenotypes, and diverse mechanisms of antibiotic resistance. Although of all these, the phase variation is the mechanism that gives the bacteria the essential adaptive advantage to face stress situations, overcome adverse environmental conditions and adapt to the host, which makes the behaviour of the bacteria to be almost unpredictable and enhances its prevalence in the environment.